レベル２培養細胞学の資料集

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＜培養細胞学資料集：細胞培養技術/細胞培養実験の意味意義」とは？＞

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このサイトでは、レベル２「細胞培養技術の実例」に関連した資料・情報を示す。その多くは図説なので「連続スライド：ココをクリック」で表示し参照する。その他は、下記項目としてこのテキスト（この頁）に示す。

＜本編の構成：「図一覧」表示にする場合は「ココ」をクリック＞　　

はじめに：動物の培養細胞/細胞培養とは？：細胞培養技術とは？

１. 主な図説項目（リスト参照はココ）、図一覧で表示（ココをクリックで表示）、

2. 基礎培地に含まれる化学成分一覧

3. 主な細胞外マトリックスの構成成分

4. 牛胎仔血清 (Fetal Bovine Serum:FBS)に含まれる成分

5. 参考書

6. 魚類培養細胞に向けた細胞培養技術（基本操作、溶液調製、継代管理）

はじめに

□1) 「培養細胞」とは、生体組織から摘出されシャーレなどで人為的に維持管理される細胞のこと。なお、繰り返し操作を加え継代培養が可能な細胞は「株化細胞」と呼ばれる。

□2) 「細胞培養」とは、生体組織の細胞が生きるその存在様式（微小環境）を人為的にシャーレなどに再現することである。なお、

□3) 動物細胞の基本的な性質は「足場依存性」であり、「細胞シートの形成」を基本とする。

□4) よって、一般的な動物細胞は、培養容器（培養フラスコなど）に「３層構造」として維持管理される。つまり、「固層、液層、気層」を必要とする。

□5) 「固相」とは、細胞が接着基質とする容器底面であり、生体においては基底膜や細胞外マトリックス（ECM）などに相当する。

□6) その接着細胞を覆う「液層」とは「培養液・培地」であり、いわゆる生体基本分子（無機塩、糖、アミノ酸、ビタミン、血清、あるいは細胞増殖因子・ホルモン）の混合液、つまり、生体物質代謝の成分に相当する。

□7) 「気相」とは培養容器の液層上部に位置する空気層であり、気相-液層-細胞層としてガス交換、つまり「内呼吸・エネルギー変換」などに関与する。

□8) つまり、培養細胞が生きるに必要な基本条件とは「接着基質、基礎培地、必須添加物（増殖因子やホルモンなど）」の３要素の充足であり、その他として「培養温度、無菌性、pH維持、細胞の継代維持」などを必要とする（細胞培養３要素＋α）。

□9) その結果、細胞培養を開始すると細胞は、容器底面（接着基質）上で、接着・伸展、移動・配列、分裂・増殖、接触阻害などの基本現象を示し、多くの培養細胞は「単層細胞シート：上皮様形態」を形成する。必要に応じて機能分化の様態に変換することも可能である。

□10) 培養細胞の振る舞いは分子レベルのシグナル伝達（情報伝達）の結果である。

□11) よって、細胞培養実験とその経過・結果は生体組織細胞との類似性から考察すべき対象となる。

□12) 上述から俯瞰する細胞培養技術とは、いわゆる「動物代替実験系」であると同時に、その構成要素・様態の詳細は、「細胞の分子生物学」に関わる状況・現象そのものである。

□13) よって、世界的な教科書「細胞の分子生物学：Molecular Biology of The Cell」の参照は不可欠である。

細胞の分子生物学（第５版）の目次（5部、全25章、1595頁）

第Ⅰ部　細胞とは　（３章 196頁）
1. 細胞とゲノム、　2. 細胞の化学と生合成、　3. タンパク質

第Ⅱ部遺伝の基本（４章 319頁）
4. DNA，染色体，ゲノム、 5. DNAの複製，修復，組換え，
6. ゲノム情報の読み取り─DNAからタンパク質へ　 7. 遺伝子発現の調節　

第Ⅲ部研究手法（２章 114頁）
8. タンパク質，DNA，RNAの操作，　9. 細胞の観察　

第Ⅳ部細胞の内部構造（９章 515頁）
10. 膜の構造、　11. 小分子の膜輸送と膜の電気的性質、　12. 細胞内区画とタンパク質の選別　
13. 細胞内における小胞の移動、　14. エネルギー変換：ミトコンドリアと葉緑体　
15. 細胞の情報伝達、　16. 細胞骨格、　17. 細胞周期、　18. アポトーシス

第Ⅴ部細胞のつくる社会（7章 466頁）
19. 細胞結合，細胞接着，細胞外マトリックス、　20. がん、　21. 有性生殖：減数分裂，生殖細胞，受精、　
22. 多細胞生物における発生、　23. 専門化した組織，幹細胞と組織の再生、　24. 病原体，感染，自然免疫
25. 適応免疫
　
＊Molecular Biology of the Cell, 4th edition＊
＜Part I. Introduction to the Cell＞
Ch1. Cells and Genomes、　Ch2. Cell Chemistry and Biosynthesis、　Ch3. Proteins
＜Part II. Basic Genetic Mechanisms＞
Ch4. DNA and Chromosomes、　Ch5. DNA Replication, Repair, and Recombination
Ch6. How Cells Read the Genome: From DNA to Protein、　Ch7. Control of Gene Expression
＜Part III. Methods＞
Ch8. Manipulating Proteins, DNA, and RNA、　Ch9. Visualizing Cells
＊Part IV. Internal Organization of the Cell
Ch10. Membrane Structure
Ch11. Membrane Transport of Small Molecules and the Electrical Properties of Membranes
Ch12. Intracellular Compartments and Protein Sorting、　Ch13. Intracellular Vesicular Traffic
Ch14. Energy Conversion: Mitochondria and Chloroplasts、　Ch15. Cell Communication、Ch16. The Cytoskeleton、　Ch17. The Cell Cycle and Programmed Cell Death、　　
Ch18. The Mechanics of Cell Division
＜Part V. Cells in Their Social Context＞
Ch19. Cell Junctions, Cell Adhesion, and the Extracellular Matrix、　Ch20. Germ Cells and Fertilization
Ch21. Development of Multicellular Organisms、　Ch22. Histology: The Lives and Deaths of Cells in Tissues
Ch23. Cancer、　Ch24. The Adaptive Immune System、　Ch25. Pathogens, Infection, and Innate Immunity

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＜1. 図一覧、連続スライドで表示可能な図説項目：連続スライドで参照：ココ＞

Fig.0・・主な細胞培養の様態
Fig.00・・培養３要素＋α
Fig.000：培養細胞の基礎知識（１）
Fig.１・・魚類の培養細胞の事例：名称
Fig.２・・培養細胞の基本的な取り扱い（５項目）
Fig.３・・細胞が生きる条件：細胞培養３要素＋α（１）
Fig.４・・細胞が生きる条件：細胞培養３要素＋α（２）
Fig.５・・細胞培養に用いる容器、様態
Fig.６・・顕微鏡観察
Fig.７・・細胞培養に用いる主な溶液（基本溶液）

Fig.８・・基本溶液の調製に必要な溶液
Fig.９・・イーグルMEMの調製法
Fig.10・・重炭酸ナトリウム液の調製法
Fig.11・・水酸化ナトリウム液の調製法
Fig.12・・L－グルタミン液の調製法
Fig.13・・牛胎仔血清の取り扱い
Fig.14・・H-MEM-5の調製法（模式図）
Fig.15・・H-MEM-5の調製法（リスト）
Fig.16・・PBS(-)の調製法（模式図）
Fig.17・・濃縮PBS(-)の調製法（リスト）
Fig.18・・0.1％Tryp液（トリプシン液）の調製法（模式図）
Fig.19・・0.1％Tryp液（トリプシン液）の調製法（リスト）

Fig.20・・クリーンベンチの物品配置
Fig.21・・細胞継代とアッセイプレートの調製（概要）
Fig.22・・操作の全体像
Fig.23・・操作ステップ１、２、３
Fig.24・・操作ステップ４
Fig.25・・操作ステップ５
Fig.26・・操作ステップ６

Fig.27・・基礎培地（イーグルMEM）の成分概要
Fig.28・・イーグルMEMの組成１
Fig.29・・イーグルMEMの組成２
Fig.30・・イーグルMEMの組成３
Fig.31・・イーグルMEMの組成４

Fig.32・・牛胎仔血清（FBS）の概要
Fig.33・・牛胎仔血清（FBS）の成分概要１
Fig.34・・牛胎仔血清（FBS）の成分概要2
Fig.35・・血清とは（１）
Fig.36・・血清とは（２）
Fig.37・・牛胎仔血清（FBS）の組成１
Fig.38・・牛胎仔血清（FBS）の組成２

Fig.39・・代表的な細胞増殖因子：名称一覧
Fig.40・・主な細胞外マトリックス（ECM）
Fig.41・・コラーゲン含量が多い臓器
Fig.42・・コラーゲン生成反応
Fig.43・・ウイルス検査の一例：プラック法
Fig.44・・コラーゲンはどこにある

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＜2. 基礎培地に含まれる化学成分一覧＞

イーグルの最小必須培地
　　（MEM：Eagle’s Minimum essential medium）
　無機塩　・・・ 6種類、　　糖類・・・　1種類
　アミノ酸　・・・14種類、　　ビタミン類など・・・　９種類
　その他1　・・・４種類、　　その他2 ・・・　pH指示薬と抗生物質

＜無機塩：6種類＞　mg/L 　mM

1 塩化ナトリウム 6800 116.35

2 塩化カルシウム 200 1.80

3 硫酸マグネシウム 200 0.81

4 塩化カリウム 400 5.37

5 重炭酸ナトリウム 2200 26.19

6 リン酸水素Na 140   1.01

＜糖類：1種類＞　mg/L 　mM

1 グルコース 1000 5.55

＜アミノ酸：14種類＞　mg/L 　mM

1 バリン 47 0.40

2 ロイシン 52 0.40

3 イソロイシン 52 0.40

4 トレオニン 48 0.40

5 システイン 32 0.18

6 シスチン 24 0.10

7 メチオニン 15 0.10

8 グルタミン 292 2.0

9 リジン 73 0.40

10 アルギニン 126 0.60

11 ヒスチジン 42 0.20

12 フェニルアラニン 33 0.20

13 チロシン 36 0.20

14 トリプトファン 10 0.05

＜ビタミン類など：9種類＞　mg/L 　nM

1 ビオチン 0.02 0.08

2 塩化コリン 1.0 7.16

3 葉酸 1.0 2.27

4 イノシトール 2.0 11.10

5 ニコチンアミド 1.0 8.19

6 パントテン酸(Ca) 1.0 2.10

7 ピリドキシン 1.0 4.91

8 リボフラビン 0.1   0.27

9 チアミン 1.0 2.96

＜その他-1 ＞　mg/L 　mM

1 コハク酸 75 0.64

2 コハク酸Na　 100 0.37

＜その他-2＞　mg/L 　mM

1 フェノールレッド（pH指示薬） 6.0 0.02

2 カナマイシン（抗生物質）　 60

・高圧滅菌やGSフィルターで滅菌
・4℃密封保存

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＜基礎培地に含まれる化学成分の一覧＞

下表に示す化学物質は下記の代表的な培地において用いられる成分（一覧）である。
なお、濃度値（数値）を表示した成分は、「イーグルの最小必須培地：MEM」である。

＊代表的な培地： MEM、DEM、F-12、DM/F12、L-15、M199、RPMI、WM752/1、

s.No No ＜無機塩＞ 水和/塩等 分子量 mg/L mM

1 1 CaCl2 anhyd 110.99 200 1.8

2 2 Ca(NO3)2 4H2O 236.15 0 0

3 3 MgCl2 6H2O 203.21 0 0

4 4 MgSO4 7H2O 246.38 200 0.81

5 5 KCl 　 74.55 400 5.37

6 6 KH2PO4 anhyd 136.09 0 0

7 7 CH3COONa 　 82.04 0 0

8 8 NaHCO3 　 84.01 2200 26.19

9 9 NaCl 　 58.44 6800 116.35

10 10 Na2HPO4 7H2O 249.98 0 0

11 11 NaH2PO4 H2O 137.98 140 1.01

s.No No ＜微量元素＞水和/塩等分子量 mg/L nM

12 1 ZnSO4 7H2O 287.44 0 0

13 2 CuSO4 5H2O 249.61 0 0

14 3 Fe(NO3)3 9H2O 403.87 0 0

15 4 FeSO4 7H2O 277.91 0 0

16 5 MnSO4 H20 169.08 0 0

17 6 (NH4)6Mo7O24 4H20 1,235.86 0 0

18 7 CoCl2 6H2O 237.93 0 0

s.No No ＜糖類＞水和/塩等分子量 mg/L mM

19 1 Galactose D- 180.16 0 0

20 2 Glucose 　 180.16 1000 5.55

s.No No ＜アミノ酸＞水和/塩等分子量 mg/L mM

21 1 Alanine L- 89.10 0 0

22 2 Alginine L-, HCl 210.67 126 0.6

23 3 Asparagine L- 132.12 0 0

24 4 Aspartic Acid L- 133.10 0 0

25 5 Cysteine L-, HCl H2O 175.66 31.4 0.18

26 6 Cystine L- 240.30 24 0.1

27 7 Glutamic Acid L- 147.13 0 0

28 8 Glutamine L- 146.15 292 2

29 9 Glycine 　 75.07 0 0

30 10 Histidine L-, HCl H2O 209.66 42 0.2

31 11 Hydroxy-L-Proline L- 131.13 0 0

32 12 Isoleucine     L- 131.17 52 0.4

33 13 Leucine L- 131.17 52 0.4

34 14 Lysine L-, HCl 182.69 73 0.4

35 15 Methionine   L- 149.21 15 0.1

36 16 Phenylalanine L- 165.19 33 0.2

37 17 Proline L- 115.13 0 0

38 18 Serine L- 105.09 0 0

39 19 Tryptophan L- 204.21 48 0.4

40 20 Tryptophan L- 204.21 10 0.05

41 21 Tyrosine L- 181.19 36 0.2

42 22 Valine L- 117.15 47 0.4

s.No No ＜ビタミン類＞水和/塩等分子量 mg/L nM

43 1 Ascorbic Acid 　 176.12 0 0

44 2 Biotin 　 244.31 0.02 0.08

45 3 Calciferol (VitaminD2) 　 396.63 0 0

46 4 Choline Chloride 　 139.63 1 7.16

47 5 Folic Acid 　 441.40 1 2.27

48 6 Menadione 　 172.17 0 0

49 7 Inositol i- 180.16 2 11.1

50 8 Niacinamide 　 122.12 1 8.19

51 9 Nicotinic Acid 　 123.11 0 0

52 10 p-Amino Benzoic Acid 　 137.13 0 0

53 11 Calcium Pantothenate D- 476.53 1 2.1

54 12 Pyridoxal HCl 203.66 1 4.91

55 13 Retinol Acetate 　 328.49 0 0

56 14 Riboflavin   　 376.36 0.1 0.27

57 15 DL-α/Tocopherol-PO4, 2Na 476.72 0 0

58 16 Thiamine HCl 337.28 1 2.96

59 17 Vitamine B-12 　 1,355.38 0 0

60 18 Lipotic Acid 　 206.32 0 0　

s.No No ＜脂質＞水和/塩等分子量 mg/L nM

61 1 Cholesterol 　 386.66 0 0

62 2 Linoleic Acid 　 280.44 0 0

s.No No ＜核酸類＞水和/塩等分子量 mg/L nM

63 1 Thymine 　 126.11 0 0

64 2 Thymidine 　 242.23 0 0

65 3 Uracil   　 112.09 0 0

66 4 Adenine H2SO4 184.14 0 0

67 5 5'-ATP-2Na   　 551.15 0 　

68 6 5'-AMP 　 347.22 0 0

69 7 Guanine HCl   187.63 0 0

70 8 Xanthine 　 152.11 0 0

71 9 Hypoxanthine 　 136.11 0 0

72 10 D-Ribose 　 150.13 0 0

73 11 Deoxyribose 　 134.13 0 0

s.No No ＜その他-1＞水和/塩等分子量 mg/L mM

74 1 Glutathione reduced 307.33 0 0

75 2 Putrescine 2HCl   161.11 0 0

76 3 Pyruvic Acid Na 111.06 0 0

77 4 Succinic acid 　 118.09 75 0.64

78 5 Sodium succinate 6H2O 270.05 100 0.37

79 6 Tween 80 - 0 0

s.No No ＜その他-2＞水和/塩等分子量 mg/L mM

80 1 HEPES（pH緩衝液）　 238.31 0 0

81 2 Phenol Red（pH指示液）　 354.39 6 0.02

82 3 Antibiotics（抗生物質）

Tween 80：モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン
Phenol Red（pH指示薬）:フェノールスルホンフタレイン (phenolsulfonphthalein)
HEPES（pH緩衝剤）
　：ヘペス、2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid
Antibiotics（抗生物質）：ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、フィンギーゾン、などを添加する。

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＜3. 主な細胞外マトリックスの構成成分＞

１）構造タンパク質
　コラーゲン（ゼラチン）、エラスチン

２）グリコサミノグリカン
　ヒアルロン酸, コンドロイチン硫酸, デルマタン硫酸,
　　ヘパラン硫酸, ヘパリン, ケラタン硫酸

３）細胞接着性タンパク質
　フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン
　フィブリノーゲン、テネイシン、トロンボスポンジン、エンタクチン、オステオポンチン、
　フォンビルブラント因子、

４）合成接着因子
　：親水化加工（プラズマ処理）のポリスチレンなど, RDGペプチド、poly-L-リジン

・・・＜先頭行へ移動＞・・・・

＜4. 牛胎仔血清 (Fetal Bovine Serum:FBS)＞

Osmolarity (353.0 mosmol.)、Total protein (5.0g/dl), K+ (9.7meq/L), Na+ (108.0meq/L), Cl- (142.0meq/L), PO4２- (9.2meq/L), Ca２+(13.9meq/L), Glucose (318.0mg/dl), BUN (15.9mg/dl), Uric acid (4.8mg/dl), Creatinine (2.4mg/dl), Total bilirubin (0.2mg/dl), Cholesterol (75.0mg/dl), Albumin (1.6g/dl), ALK phosphatase (146.0mU/ml), CPK (187.0mU/ml),LDH (437.0mU/ml), SGOT (45.0mU/ml), T4 (7.8μg/ml)、Total cortisol (9.6μg/ml), Free cortisol (1.3μg/ml), Corticosterone (0.4μg/ml), Testosterone (53.0ng/dl)、 Insulin (10.1μU/ml), Total glucagon (286.0pg/ml)、 Pancreatic glucagon (97.0pg/ml), ACTH (14.9pg/ml)、TSH (1.1μIU/ml), GH (87.0ng/ml),FSH (1.6mIU/ml)、
LＨ (1.8mIU/ml), Prolactin (27.7ng/ml),Fibronectin (0.03mg/ml), その他：EGF, PDGF, IGF-1, etc

Osmolarity （浸透圧）・・・ 353.0 mOsmol
Total protein （総タンパク量）・・・ 5.0g/dl
K+ （カリウムイオン）・・・ 9.7meq/L
Na+ (ナトリウムイオン) ・・・ 108.0meq/L
Cl- (塩素イオン) ・・・ 142.0meq/L
PO4２- (リン酸イオン) ・・・ 9.2meq/L
Ca２+ (カルシウムイオン) ・・・ 13.9meq/L
Glucose (グルコース) ・・・ 318.0mg/dl
BUN （血液尿素窒素Blood urea nitrogen）・・・ 15.9mg/dl
Uric acid （尿酸）・・・ 4.8mg/dl
Creatinine （クレアチニン）・・・ 2.4mg/dl
Total bilirubin （総ビリルビン）・・・ 0.2mg/dl
Cholesterol （コレステロール）・・・ 75.0mg/dl
Albumin （アルブミン）・・・ 1.6g/dl
ALK phosphatase （アルカリホスファターゼ Alkaline Phosphatase）・・・ 146.0mU/ml
CPK （クレアチンホスホキナーゼ Creatine PhosphoKinase）・・・ 187.0mU/ml
LDH （乳酸脱水素酵素lactate dehydrogenase）・・・ 437.0mU/ml
SGOT （血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ
　　　　　　　Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase）・・・ 45.0mU/ml
T4 （サイロキシン Thyroxin）・・・ 7.8μg/ml
Total cortisol （総コルチゾール）・・・ 9.6μg/ml
Free cortisol（遊離コルチゾール）・・・ 1.3μg/ml
Corticosterone （コルチコステロン）・・・ 0.4μg/ml
Testosterone （テストステロン）・・・ 53.0ng/dl
Insulin （インシュリン）・・・ 10.1μU/ml
Total glucagon （総グルカゴン）・・・ 286.0pg/ml
Pancreatic glucagon （膵グルカゴン）・・・ 97.0pg/ml
ACTH （副腎皮質刺激ホルモン adrenocorticotropic hormone）・・・ 14.9pg/ml
TSH （甲状腺刺激ホルモン thyroid stimulating hormone）・・・ 1.1μIU/ml
GH （成長ホルモン Growth Hormone）・・・ 87.0ng/ml
FSH （濾胞刺激ホルモン Follicle Stimulating Hormone）・・・ 1.6mIU/ml
LＨ（黄体刺激ホルモン Lutenizing Hormone）・・・ 1.8mIU/ml
Prolactin （プロラクチン）・・・ 27.7ng/ml
Fibronectin （フィブロネクチン）・・・ 0.03mg/ml
EGF （上皮成長因子Epidermal Growth Factor）・・・ (微量)
PDGF （血小板由来成長因子 Platelet-Derived Growth Factor）・・・ (微量)
IGF-1 （インスリン様成長因子 Insulin-like growth factor）・・・ (微量)、
etc