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＜ “考える生物学”の演習・協議 ＞

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＜演習の目次＞

演習1（Exp2）. 培養温度とゼラチンの物性について考えてみましょう。

演習2.

協議１.階層性（構造レベル）と器官系区分について

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演習１：培養温度とゼラチンの物性について考えてみましょう。

＜話 題＞ お絵描き実験（Exp2）の手順（工程概要）に従い、下記の設定条件で実験を行いました。なお、この座学「演習」での１次培養の温度は３０℃ですが、設定４（対照区）は22℃です。その結果、どの条件においても１次培養・１時間後には「細胞シート」が形成されましたが、２次培養を継続したところ結果に差異が生じました。

＜工程概要＞ １）ゼラチン（Gel）塗抹済みのシャーレを、 ２）メチルセルロース(MC)で処理し、 ３）遠心再浮遊した細胞をシャーレに添加し、 ４）所定の温度で静置培養（1次培養と２次培養）を行った。 補足：1次培養ではカルシウム（Ca）を含まない無血清無蛋白培養液(B-Med)を用います。２次培養で用いる培養液（Ca-Med）はカルシウム（Ca）を十分量含むB-Medです。Gelは変性コラーゲン、MCは血清アルブミンの代替として使用しています。 ＊本実験の基本方法のイメージは下図です。

＜設定条件と結果＞ 設定１. １次培養（30℃/１時間）により綺麗な細胞シートが出来たので、２次培養液（Ca-Med）に交換し「30℃で２次培養」を行った。１時間後に顕微鏡観察するとほとんどの細胞は剥がれ落ちていた。 設定２. ２次培養のためCa-Medに交換した後、培養温度を室温（22℃）に変え培養した。１時間後に観察すると細胞間にかなり隙間が生じていた。 設定３. １次培養30℃・１時間後のシャーレを室温（22℃）に移しそのまま１次培養を継続した。その１時間後に２次培養液（Ca-Med）に交換し更に１時間培養を行った。この条件でも細胞シートに少し隙間が生じた。 設定4. １次培養の対照区として22℃（室温）も設定した。この場合、１時間後には30℃と同様に綺麗な細胞シートであった。その後Ca-Medによる２次培養を１時間継続したが細胞シートはそのまま維持された。

＜結果評価＞ 設定 １次培養 （温度/時間） 液替え時の 検鏡評価１ ２次培養 （温度/時間） 固定前の状況 検鏡評価２ 気付いたこと （キーワード/メモ 1 30℃/1hr. ＋３ 30℃/1hr. ＋１   2 30℃/1hr. ＋３ 22℃/1hr ＋２   3 30℃/1hr. +22℃/30min. ＋４ 22℃/1hr ＋３   4 2２℃/1hr. ＋３ 22℃/1hr ＋３   評価基準（Exp2）：細胞の接着伸展の状態をシンボル化して表示すると、　 〔＋４〕基質（底面）上の接着細胞はほとんどが十分に伸展した。その結果、隣接細胞の集合域は単層で隙間なく綺麗な配列を示した（基質全域で敷石を敷き詰めたような細胞シートが形成された）。 〔＋３〕細胞は十分に伸展しているが、顕微鏡レベルでは隣接細胞間に少し隙間が観察される。 〔＋２〕細胞の伸展状況は不十分であり、顕微鏡レベルで隣接細胞間にかなり隙間が観察される。 〔＋１〕細胞の伸展状況は不十分であり、肉眼レベルで隙間が生じている。 〔＋—〕細胞は球状のままであるが接着はしている。　〔 — 〕細胞は基質に接着していない。 補足１（ヒント）:乾燥ゼラチンは吸水すると膨化し温度依存で軟化します。Caイオンは細胞接着を強化します（インテグリンと接着基質との結合を安定化します）。　補足２：隙間のない綺麗な細胞シート（＋４）を形成させるに必要な１次培養の培養時間は90分間以上です。

＜演習１の考察/質問＞ Q1.　お絵描き実験を首尾よく完了させる（付帯条件：迅速・簡便・確実）、つまり、・実践学習の場で綺麗な細胞シートで「絵文字」を仕上げるためはどのようなことに注意すれば良いでしょうか。下記「選択肢」からその重要度を考慮し優先順位で回答してください（電子メールでお願いします）。 　選択肢 ：a.ゼラチン塗抹、b.細胞の単離分散、c.１次培養の時間、d.培養温度、e.２次培養時間、 　回答：１番目＿、２番目＿、３番目＿、４番目＿、５番目＿、他で重要な事項＿＿＿ Q2. Q1に関連して（余裕があればお願いします） １）「1.感想、2.意見、3.疑問、4提案」を区分対応でご回答をお願いします。 ２）本演習を「受講者の課題」とする場合、どのような視点で扱うことが可能ですか。 ３）模式図（側面構造図：要素の配置と繋がり）を描くことが理解への近道と思いますが、如何でしょうか。 先頭行へ移動

実験方法：Exp2「お絵描き実験」の工程概要

1.準備・前処理

Step1（ゼラチン塗抹）. 湯煎溶解ゼラチン（Gel）を綿棒に付け、培養シャーレに「任意の絵文字」を描き（厚塗りしてはいけない）、完全に乾燥させる。

Step2（MC処理）. そのシャーレにメチルセルロース液（MC：血清アルブミンの代替）を滴下し、底面全域を濡らしたらその余液を捨てる。

2.細胞液の調製

Step3-1（細胞分散）. フィルムバッグ細胞をスポイトで浮遊分散させる。

Step3-2（遠心再浮遊）. 細胞液を遠心再浮遊し「細胞洗浄と細胞の単離分散化」を図る。

3.細胞培養

Step4-1（１次培養）. 細胞液（Cell）をシャーレに加え、所定の温度で静置培養を開始する（90分以上、できるだけ長く設定すると良い結果となる。半日程度でも良い）。

Step4-2（状況確認）. 75分？後、シャーレに回転・振動を与え、未接着の細胞を浮遊させ、その上澄み（細胞液）を紙コップ（新品）に回収する。同時にシャーレ底面の状態を目視確認する（任意の絵文字が出来ているはず：乾燥に注意）。目視確認後は細胞液をシャーレに戻して継続して培養（１次培養は最低90分間以上行う。半日程度行っても良い）。

Step4-3（2次培養）.１次培養が終了したらStep4-2に従い底面を再度確認し、その細胞液を除いたい後、そのシャーレに２次培養液（Ca-Med）を滴下し、所定温度で培養を継続する（10分程度でも良い。または２次培養を実施しなくても良い）。

4.固定染色

Step5. 培養液を捨て固定処理（G-Fix）・染色処理（CV）を行う。

＜＜演習は以上で終わりです＞＞

＜		演習１は終了：先頭行へ移動：演習１は終了		＞

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＜はじめに＞

　　
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＜1-3＞

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＜4-7＞

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＜7-9＞

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＜10-12＞

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＜13-15＞

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＜16-18＞

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＜19-21＞

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＜22-24＞

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＜25-27＞

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＜28-30＞

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＜31-33＞

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＜34-36＞

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＜37-39＞

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＜40-42＞

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＜43-45＞

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＜46-48＞

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＜49-51＞

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（画像クリックで拡大表示：　左 Fig.49 　　中 Fig.50 　　右 Fig.51)　
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＜52-54＞

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（画像クリックで拡大表示：　左 Fig.52 　　中 Fig.53 　　右 Fig.54)　
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＜55-57＞

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（画像クリックで拡大表示：　左 Fig.55 　　中 Fig.56 　　右 Fig.57)　
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＜58-60＞

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